Fraccionador isotrópico: el ‘método de la sopa de cerebro’

Durante décadas, las y los investigadores intentaron responder preguntas fundamentales sobre la organización del sistema nervioso mediante técnicas histológicas y estereológicas que, aunque proporcionaban resultados valiosos, requieren procedimientos complejos, largos periodos de trabajo y un elevado grado de especialización. Estas limitaciones dificultaban la obtención de estimaciones rápidas y comparables entre distintas especies, lo que restringía el estudio de la evolución cerebral y de las reglas que gobiernan la organización del encéfalo. En este contexto, surgió el método del fraccionador isotrópico, una técnica desarrollada por Suzana Herculano-Houzel y Roberto Lent, que transformó la manera de cuantificar las células del cerebro al convertir el tejido nervioso en una suspensión homogénea de núcleos celulares, simplificando de manera considerable el proceso de conteo (Herculano-Houzel, Lent, 2005).

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Desde su publicación, el método del fraccionador isotrópico ha permitido revisar numerosas ideas previamente aceptadas acerca del cerebro humano y de otros mamíferos. Gracias a esta estrategia, fue posible demostrar que el cerebro humano contiene aproximadamente 86 mil millones de neuronas y que el número de células gliales es similar al de neuronas, desmintiendo la creencia de que las células gliales superaban a las neuronas en una proporción de diez a uno (Azevedo et al., 2009; Herculano-Houzel, 2009). Asimismo, el método ha impulsado investigaciones sobre la evolución del cerebro, las reglas de escalamiento neuronal y las restricciones metabólicas que condicionaron el desarrollo del sistema nervioso en los primates y en la especie humana (Fonseca-Azevedo, Herculano-Houzel, 2012).

¿Cómo se contabilizaban las neuronas?

Antes del desarrollo del método del fraccionador isotrópico, determinar cuántas neuronas y otras células componían un cerebro era una tarea extraordinariamente compleja. Durante gran parte del siglo XX, los neurocientíficos dependieron de técnicas histológicas tradicionales que consistían en fijar el tejido cerebral, cortarlo en secciones muy delgadas, teñirlas con diferentes colorantes y observarlas mediante microscopía. A partir de estas preparaciones, los investigadores intentaban estimar el número total de neuronas contando únicamente una pequeña muestra de células y extrapolando posteriormente los resultados al volumen completo del tejido. Aunque este enfoque permitió importantes avances en el conocimiento de la organización cerebral, también introducía diversas fuentes de error relacionadas con el tamaño de las células, el grosor de los cortes, la deformación del tejido durante el procesamiento y el sesgo en la selección de las muestras (Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Con el propósito de reducir estos problemas, durante las últimas décadas del siglo XX se consolidó el uso de la estereología moderna, un conjunto de procedimientos estadísticos diseñados para obtener estimaciones tridimensionales imparciales a partir de cortes bidimensionales del tejido cerebral. Entre estos procedimientos destacó el denominado optical fractionator, considerado durante muchos años el estándar de referencia para estimar el número de neuronas en regiones específicas del encéfalo. Este método combinaba un muestreo sistemático y aleatorio con reglas matemáticas que permitían calcular el número total de células presentes en una estructura determinada sin necesidad de contarlas una por una (Deniz et al., 2018).

Limitaciones

A pesar de representar un avance significativo respecto de los métodos histológicos clásicos, la estereología continuaba siendo un procedimiento lento y altamente demandante. Su aplicación requería equipamiento especializado, microscopios de alta precisión, programas de análisis de imágenes y personal con una amplia capacitación técnica. Además, el procesamiento de un solo cerebro podía prolongarse durante semanas o incluso meses, especialmente cuando era necesario analizar múltiples regiones anatómicas por separado. Estas dificultades limitaban considerablemente el número de muestras que podían estudiarse y dificultaban la comparación entre especies con cerebros muy distintos en tamaño y organización (Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Otro inconveniente importante era que las estimaciones dependían de numerosos supuestos metodológicos. Los cambios producidos durante la fijación del tejido, la pérdida de material en los cortes histológicos o las diferencias en la delimitación anatómica de las regiones cerebrales podían modificar los resultados obtenidos por distintos laboratorios. Como consecuencia, existían discrepancias notables en las cifras publicadas sobre el número de neuronas de muchas especies, incluido el ser humano (Herculano-Houzel, 2009).

Las limitaciones de estos enfoques impulsaron la búsqueda de un método más sencillo, rápido y reproducible que permitiera cuantificar directamente el número total de células del cerebro sin depender de complejos modelos de extrapolación. Esta necesidad condujo al desarrollo del fraccionador isotrópico, una innovación metodológica que transformó el tejido cerebral en una suspensión homogénea de núcleos celulares, facilitando el conteo directo y reduciendo significativamente el tiempo requerido para obtener estimaciones confiables (Herculano-Houzel, Lent, 2005).

¿En qué consiste el fraccionador isotrópico o ‘método de la sopa de cerebro’?

El método del fraccionador isotrópico, conocido también de manera informal como el ‘método de la sopa de cerebro’, tiene el objetivo de cuantificar de forma rápida y confiable el número total de células y neuronas presentes en el cerebro. Su principal innovación consiste en abandonar el análisis de cortes histológicos individuales y transformar el tejido nervioso en una suspensión homogénea de núcleos celulares. Al eliminar la necesidad de conservar la arquitectura tridimensional del cerebro durante el conteo, este método simplifica considerablemente el procedimiento y permite obtener estimaciones globales con una precisión comparable a la de técnicas mucho más laboriosas (Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Es importante destacar que este método no pretende reconstruir la organización anatómica del cerebro ni describir la posición de cada neurona dentro de un circuito específico. En cambio, su fortaleza radica en proporcionar una medida cuantitativa global de la composición celular del tejido. Gracias a esta estrategia fue posible demostrar que muchas estimaciones tradicionales sobre el cerebro humano eran inexactas, particularmente aquellas relacionadas con el número total de neuronas y con la proporción entre neuronas y células gliales. Asimismo, el fraccionador isotrópico facilitó la comparación entre especies con cerebros muy diferentes en tamaño, permitiendo descubrir reglas generales sobre el escalamiento celular de los mamíferos y proporcionando una nueva perspectiva para comprender la evolución del sistema nervioso (Azevedo et al., 2009; Herculano-Houzel, 2009).

Preparando la ‘sopa de cerebro’

El procedimiento comienza con la extracción de la región cerebral que se desea analizar. El tejido se fija para preservar sus componentes celulares y posteriormente se somete a una disgregación mecánica en presencia de una solución detergente. Este proceso rompe las membranas celulares, pero mantiene intactos los núcleos, que son mucho más resistentes. Como resultado se obtiene una suspensión uniforme en la que los núcleos quedan distribuidos de manera aleatoria dentro del líquido.

Una vez obtenida la suspensión, los núcleos celulares se tiñen con un marcador, habitualmente DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol), que permite visualizar fácilmente cada núcleo bajo un microscopio de fluorescencia. Debido a que cada célula posee un único núcleo, contar los núcleos equivale a contar el número total de células presentes en la muestra. Para ello se toma una pequeña alícuota de la suspensión homogénea y se introduce en una cámara de Neubauer u otro dispositivo de conteo celular. A partir del número de núcleos observados y del volumen total de la suspensión es posible calcular, mediante una sencilla extrapolación matemática, el número total de células existentes en la región analizada.

El método del fraccionador isotrópico también permite distinguir las neuronas del resto de las células del sistema nervioso. Para conseguirlo, una parte de la suspensión se somete a un procedimiento de inmunomarcaje utilizando anticuerpos dirigidos contra proteínas específicas de los núcleos neuronales, especialmente NeuN. Los núcleos que reaccionan positivamente con este marcador se identifican como neuronales, mientras que aquellos que no presentan la señal corresponden principalmente a células gliales y otros tipos celulares no neuronales. De esta manera, el investigador puede estimar tanto el número total de células como la proporción de neuronas y de células no neuronales presentes en el tejido cerebral (Herculano-Houzel, 2021; Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Ventajas del método del fraccionador isotrópico

La aparición del método del fraccionador permitió superar muchas de las limitaciones asociadas con las técnicas histológicas y estereológicas tradicionales.

Reducción del tiempo: Mientras que los estudios estereológicos pueden prolongarse durante semanas o incluso meses, el método del fraccionador isotrópico permite obtener estimaciones del número total de células en un periodo mucho más corto.
Proceso experimental más simple: La conversión del tejido cerebral en una suspensión homogénea de núcleos elimina la necesidad de reconstruir tridimensionalmente las estructuras anatómicas.
Relativa sencillez técnica: A diferencia de algunos procedimientos estereológicos que requieren microscopios motorizados de alta precisión, programas especializados para análisis tridimensional y una capacitación extensa del personal, el método puede llevarse a cabo utilizando equipamiento disponible en numerosos laboratorios de biología celular y neurociencia.
Ofrece estimaciones globales directas: Debido a que cada núcleo permanece íntegro tras la disgregación del tejido, el conteo se basa en la cuantificación física de los núcleos presentes en una suspensión homogénea y no en la extrapolación de pequeñas áreas seleccionadas del cerebro.
Capacidad para facilitar comparaciones evolutivas entre especies: Gracias a la rapidez del método, los investigadores pudieron analizar cerebros completos de numerosos mamíferos utilizando un protocolo uniforme, lo que permitió descubrir que distintos grupos animales siguen reglas de escalamiento celular diferentes.
Versatilidad: La técnica puede aplicarse al estudio de cerebros completos o de regiones específicas, así como a especies muy diversas, desde pequeños roedores hasta grandes primates. Además, puede combinarse con otras metodologías histológicas, moleculares o de neuroimagen para complementar la información obtenida, permitiendo integrar datos sobre cantidad celular, organización anatómica y función cerebral.

(Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Lo que sabemos ahora del cerebro humano

Durante décadas se afirmó que el encéfalo contenía alrededor de 100 mil millones de neuronas; sin embargo, el empleo del método del fraccionador isotrópico permitió establecer una cifra cercana a los 86 mil millones de neuronas, distribuida de manera desigual entre las diferentes estructuras cerebrales. Este resultado, obtenido mediante el análisis de cerebros humanos completos, proporcionó una estimación más sólida y basada en un protocolo experimental homogéneo.

De igual forma, el método permitió refutar uno de los mitos más difundidos en neurociencia: la supuesta proporción de diez células gliales por cada neurona. Los análisis realizados mediante el fraccionador isotrópico demostraron que el cerebro humano posee cantidades muy similares de células neuronales y no neuronales, aunque la proporción varía considerablemente entre regiones.

La utilización del método del fraccionador isotrópico también permitió comprender mejor cómo se distribuyen las neuronas en las distintas regiones cerebrales. Estudios comparativos mostraron que la corteza cerebral presenta una marcada heterogeneidad en la densidad neuronal, desmintiendo la idea de que todas las áreas corticales poseen una organización celular semejante.

Asimismo, este método hizo posible establecer que el cerebro humano no constituye una excepción dentro de la evolución de los primates. Gracias al análisis de numerosas especies mediante un mismo procedimiento, se comprobó que el cerebro humano sigue las mismas reglas generales de escalamiento celular que caracterizan al resto de los primates. En otras palabras, nuestro encéfalo puede entenderse como un cerebro de primate ampliado que conserva relaciones predecibles entre masa cerebral, número de neuronas y organización celular, en lugar de representar una estructura completamente distinta desde el punto de vista biológico (Azevedo et al., 2009; Herculano-Houzel et al., 2007; Herculano-Houzel, 2009).

Aplicaciones del método del fraccionador isotrópico en la investigación

Una de las aplicaciones más importantes del fraccionador isotrópico ha sido el estudio comparativo de la evolución cerebral entre diferentes especies. La utilización de un protocolo uniforme permitió cuantificar el número de neuronas en cerebros de roedores, primates y otros mamíferos, haciendo posible identificar patrones generales de organización celular. Estas investigaciones demostraron que los distintos órdenes de mamíferos no siguen una única regla de escalamiento entre el tamaño del cerebro y el número de neuronas (Herculano-Houzel et al., 2006; Herculano-Houzel, 2009).

El método del fraccionador isotrópico también ha sido fundamental para investigar la organización interna del cerebro. Al aplicarse de manera independiente a estructuras como la corteza cerebral, el cerebelo o el tronco encefálico, ha permitido determinar cómo se distribuyen las neuronas y las células no neuronales en cada región. Gracias a ello, se descubrió que la corteza cerebral presenta una marcada variabilidad en la densidad neuronal y que diferentes áreas corticales contienen cantidades muy distintas de neuronas por unidad de masa (Herculano-Houzel et al., 2007).

En el ámbito de la investigación biomédica, el método del fraccionador isotrópico también ha encontrado aplicaciones en el estudio de enfermedades neurológicas y modelos experimentales. La posibilidad de cuantificar de manera precisa la pérdida o conservación de neuronas permite evaluar el impacto de procesos neurodegenerativos, lesiones traumáticas, enfermedades del desarrollo y diversas intervenciones terapéuticas. Asimismo, la técnica facilita la comparación entre grupos experimentales y controles, aportando datos objetivos sobre los cambios en la composición celular del tejido nervioso. Aunque en muchos casos debe complementarse con estudios histológicos para localizar las alteraciones anatómicas, el fraccionador isotrópico constituye una herramienta eficaz para establecer si existe una disminución real del número de neuronas o de otros tipos celulares (Deniz et al., 2018).

Limitaciones del método del fraccionador isotrópico

A pesar de que el método del fraccionador isotrópico ha revolucionado la cuantificación celular en neurociencia, sus propios desarrolladores y numerosos investigadores han señalado que no constituye una solución universal para todos los problemas relacionados con el estudio del cerebro.

La principal limitación del método deriva precisamente del procedimiento que le da nombre. Para obtener una suspensión homogénea de núcleos celulares es necesario disgregar completamente el tejido cerebral, destruyendo de manera irreversible su organización tridimensional. Como consecuencia, una vez procesada la muestra ya no es posible identificar la localización exacta de cada neurona, reconstruir circuitos neuronales ni estudiar la disposición espacial de las células dentro de una región específica. En otras palabras, el fraccionador isotrópico proporciona información cuantitativa sobre cuántas células existen, pero no sobre dónde se encuentran ni cómo se relacionan entre sí. Cuando estas características son relevantes para una investigación, resulta indispensable recurrir a técnicas histológicas convencionales o a métodos de microscopía que preserven la arquitectura del tejido (Deniz et al., 2018).

Otra limitación importante es que el método del fraccionador isotrópico depende de la identificación correcta de los distintos tipos celulares mediante marcadores moleculares. Para diferenciar las neuronas de las células no neuronales suele utilizarse el anticuerpo NeuN, que reconoce una proteína presente en los núcleos de la mayoría de las neuronas maduras. Sin embargo, no todas las poblaciones neuronales expresan este marcador con la misma intensidad y existen determinados tipos de neuronas que pueden presentar una inmunorreactividad débil o incluso carecer de ella. En estos casos, parte de las neuronas podría no ser identificada correctamente, generando una ligera subestimación de su número (Herculano-Houzel, Lent, 2005; Deniz et al., 2018).

Referencias:

Azevedo, F., et al. (2009). Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology, 513(5), 532–541. researchgate.net
Barrecheguren, P. (2022). El invento que revolucionó la neurociencia: el fraccionador isotrópico. Blog: Miravalles, A. F. annafores.wordpress.com
De Holanda, N., et al. (2026). Human brain cognition revealed by Suzana Herculano-Houzel’s isotropic fractionator studies. Revista Neurociências, 34, 1-34. periodicos.unifesp.br
Deniz, Ö., et al. (2018). A concise review of optical, physical and isotropic fractionator techniques in neuroscience studies, including recent developments. Journal of neuroscience methods, 310, 45–53. pmc.ncbi.nlm.nih.gov
Fonseca-Azevedo, K., Herculano-Houzel, S. (2012). Metabolic constraint imposes tradeoff between body size and number of brain neurons in human evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(45), 18571–18576. researchgate.net
Herculano-Houzel, S. (2009). The human brain in numbers: A linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience, 3, 31. researchgate.net
Herculano-Houzel, S. Curso: (2021). Brain Soup: The Isotropic Fractionator. World Science U. worldscienceu.com
Herculano-Houzel, S., et al. (2006). Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(32), 12138–12143. pnas.org
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Herculano-Houzel, S., Lent, R. (2005). Isotropic fractionator: a simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 25(10), 2518–2521. pmc.ncbi.nlm.nih.gov